Las enzimas de restricción y el ADN recombinante

Las enzimas de restricción y el ADN recombinante

Cortar una molécula de ADN en un punto elegido y soldarle después otro fragmento es la operación que abrió la biotecnología moderna. Las herramientas de ese corte y pega son dos enzimas: la de restricción y la ligasa.

El repaso sigue el recorrido completo del procedimiento. Explica qué corta cada enzima, cómo se sella la unión, qué vehículo transporta el gen y cómo se reconoce la bacteria que lo recibió.

Al final hay dos casos resueltos con sus cuentas, dos tablas de repaso y las fuentes consultadas.

Conviene ordenar el estudio con tres preguntas: quién corta, quién pega y quién lleva el gen al interior de la célula. Cada paso del procedimiento responde a una de ellas.

El procedimiento completo cabe en cinco pasos: cortar, ligar, transformar, seleccionar y multiplicar. Todo lo que sigue es el detalle de esa lista.

El tema importa más allá del examen. Con estas herramientas se fabrican medicamentos, se diagnostican enfermedades y se modifican cultivos, y casi todo eso empieza con un corte bien elegido.

Qué son las enzimas de restricción

Una enzima de restricción es una proteína que corta el ADN en un punto predecible. Se le llama también endonucleasa porque rompe la cadena por dentro y no en los extremos.

Las bacterias las fabrican como defensa frente al material genético que llega de fuera. Los virus que las infectan introducen su ADN, y estas enzimas lo trozan antes de que se multiplique.

Los laboratorios tomaron esas mismas proteínas y las convirtieron en tijeras de precisión. Con ellas se puede separar un gen de un genoma entero sin destruirlo.

No sirve cualquier nucleasa para ese trabajo. Una enzima que corta al azar deja una mezcla de fragmentos de todos los tamaños, y de ahí no se recupera un gen concreto.

La enzima de restricción, en cambio, produce un juego de piezas reproducible. Cada molécula cortada con ella da el mismo patrón de tamaños, y ese patrón se puede separar y comparar.

El resultado de una digestión se puede ver. Los fragmentos se separan por tamaño en un gel y aparecen como una serie de bandas, cada una con su longitud.

La cantidad de piezas depende del número de sitios que tenga la molécula. Cuantos más reconozca la enzima en ese ADN, más fragmentos aparecerán en el tubo.

Cada enzima tiene su propia secuencia blanco y no reconoce otra. Esa estrechez de miras es justamente lo que la vuelve útil como herramienta.

El nombre de cada una resume su origen. EcoRI, por ejemplo, se aisló de una cepa de Escherichia coli y conserva esas siglas en la etiqueta.

Como el corte depende de una secuencia exacta, el resto de la molécula queda intacto. La enzima actúa donde está su blanco y no toca lo demás.

El sitio de corte y los dos tipos de extremo

El sitio de corte es el tramo corto de bases donde la enzima se ancla y rompe. La misma enzima encuentra ese tramo en cualquier ADN que lo contenga, venga de una bacteria o de una célula humana.

Esos tramos tienen una simetría curiosa. Se leen igual en un sentido y en el inverso de la hebra complementaria, y por eso se llaman palíndromos.

La matemática del asunto ayuda a prever los cortes. Una secuencia de seis pares de bases aparece, en promedio, una vez cada 4.096 pares si las cuatro bases se reparten al azar.

El corte rompe el enlace fosfodiéster entre el fosfato y el azúcar. Lo hace una vez en cada hebra, y la forma de hacerlo decide qué tipo de extremo queda.

Si la enzima corta en escalón, una hebra sobresale un poco más que la otra. Ese saliente se llama extremo pegajoso y es el que deja EcoRI.

Si corta justo por el centro, las dos hebras terminan parejas. El resultado es un extremo romo, como el que producen SmaI y EcoRV.

No todas las enzimas de corte recto son iguales. EcoRV reconoce su propia secuencia de seis bases y rompe por el centro, y AluI y HaeIII también dejan extremos romos.

La forma del corte también define si dos piezas encajan. Un saliente solo se aparea con otro que sea su complemento exacto, y por eso el tipo de extremo manda en el empalme.

La compatibilidad entre extremos decide qué se puede unir. Dos fragmentos cortados con EcoRI se empalman entre sí, pero uno de EcoRI no se pega a uno de SmaI.

Los extremos romos ofrecen más libertad y menos control. Se pueden unir con cualquier otro extremo romo, aunque el fragmento puede entrar en cualquiera de las dos orientaciones.

La ADN ligasa y el armado del ADN recombinante

Los extremos pegajosos se aproximan por complementariedad de bases, pero ese contacto es débil. La ADN ligasa llega después y sella la unión con enlaces covalentes.

Lo que hace es reconstruir el esqueleto de azúcar y fosfato en las dos hebras. Cuando termina, el fragmento insertado queda tan unido como si hubiera estado allí desde el principio.

El procedimiento habitual tiene tres momentos. Se cortan el fragmento y el vector con la misma enzima, se mezclan y se agrega la ligasa.

De esa mezcla sale una molécula que no existía antes en la naturaleza. Ese producto recibe el nombre de ADN recombinante porque combina material genético de orígenes distintos.

El ADN de partida puede venir de una célula, fabricarse en el laboratorio o copiarse de un ARN mensajero. La elección depende de lo que se busque después.

La mezcla nunca es perfecta. Parte del vector queda sin inserto y parte del fragmento se liga consigo mismo, así que el paso siguiente debe separar unos de otros.

La molécula armada todavía está en un tubo. Para que se multiplique hay que introducirla en una célula hospedadora, casi siempre una bacteria, y seleccionar las que la incorporaron.

Ese conjunto de pasos, del tubo al cultivo y del cultivo a la colonia aislada, es lo que se conoce como clonación molecular.

Los vectores: el vehículo que lleva el gen

Un vector es la molécula de ADN que transporta el fragmento de interés hacia el interior de la célula. Sin vehículo, un gen ajeno no se copiaría ni se expresaría en una bacteria.

Todo vector bien construido reúne tres elementos. Necesita un origen de replicación para copiarse por su cuenta, un sitio de multiclonación donde insertar el fragmento y un marcador de selección para reconocer la célula que lo recibió.

El plásmido es el vector más usado en la enseñanza y en la industria. Es un anillo pequeño de ADN que se replica aparte del cromosoma bacteriano, y en pocas horas la bacteria acumula cientos o miles de copias.

Los vectores virales aprovechan la capacidad de un virus para entrar en una célula. Al fago lambda se le quitan los genes que no necesita como vehículo y se conserva lo que sirve para empaquetar ADN.

Los cósmidos combinan las dos ideas anteriores. Son plásmidos a los que se añade una señal de empaquetado del fago, y con eso aceptan fragmentos más largos que un plásmido común.

Los cromosomas artificiales son construcciones mayores. Se usan cuando el fragmento es tan extenso que los vectores pequeños no lo sostienen.

Cada vector impone un límite de tamaño. Un fragmento mayor que su capacidad no se puede empaquetar, y por eso la elección se hace antes de empezar.

En la práctica se elige por tres criterios: el tamaño del fragmento, el hospedador que se va a usar y lo que se espera obtener al final.

Para producir una proteína humana suele bastar un plásmido. Un gen muy largo, en cambio, exige un vehículo mayor.

La transformación bacteriana y la selección de colonias

Meter el plásmido dentro de la bacteria se llama transformación. La pared celular es una barrera seria, así que las células se preparan antes con tratamientos químicos, con frío o con una descarga eléctrica.

Aun con esa preparación, solo una parte pequeña del cultivo incorpora el plásmido. Por eso hace falta un sistema que distinga a las que lo tienen de las que no.

Ese sistema es el marcador de selección. El vector lleva un gen que le da a la bacteria una ventaja reconocible, casi siempre la resistencia a un antibiótico.

La electroporación es una de las vías para abrir la célula. Consiste en un pulso eléctrico breve que vuelve permeable la membrana por un instante.

Las bacterias se siembran en una placa con ese antibiótico. Las que no llevan el plásmido mueren, y cada una de las que sobreviven crece como una colonia separada.

Queda un problema: un plásmido puede entrar vacío, sin el fragmento. Para distinguirlo se coloca el sitio de multiclonación dentro de un gen indicador, de modo que el inserto lo interrumpa.

Las colonias con el gen indicador intacto se ven de un color, y las que llevan el inserto se ven de otro. Así se separan los clones recombinantes de los plásmidos sin fragmento.

La selección tiene un costo que conviene recordar. El antibiótico mata a la mayoría del cultivo y solo deja vivas a las portadoras del vector.

El número de colonias también informa. Cada colonia proviene de una bacteria y permite estimar qué proporción del cultivo quedó transformada.

Del ADN copia a la proteína: expresión y aplicaciones

Si el gen proviene de una célula humana aparece un obstáculo. En el genoma ese gen está interrumpido por intrones, tramos que no forman parte de la proteína final.

La célula humana elimina los intrones al madurar el ARN. La bacteria no hace ese trabajo, así que un gen humano completo no se lee bien dentro de ella.

La salida es partir del ARN mensajero ya maduro. Con la transcriptasa inversa se copia ese ARN y se obtiene un ADN copia que solo contiene las regiones codificantes.

Para expresar el gen tampoco sirve cualquier vector. Se necesita un vector de expresión, con un promotor fuerte y una señal que la bacteria reconozca para empezar a traducir.

El primer medicamento obtenido con esta tecnología fue la insulina humana. La Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos aprobó la Humulin el 28 de octubre de 1982, y fue el primer producto médico derivado del ADN recombinante.

Antes de esa fecha la hormona se extraía del páncreas de animales de matadero. Producirla en bacterias resolvió un problema de suministro y de precio que venía de los años veinte.

La quimosina ofrece un caso más cotidiano. Es la enzima que cuaja la leche para hacer queso, y desde 1990 se obtiene de microorganismos modificados con el gen bovino correspondiente.

Hoy la producen hongos y bacterias, entre ellos Aspergillus niger, Kluyveromyces lactis y Escherichia coli. Su secuencia es similar a la del cuajo que se extraía del estómago de terneros.

Ese cambio de hospedador tiene una ventaja económica clara. Un cultivo microbiano crece en días y no depende de la disponibilidad de tejido animal.

Las enzimas industriales de detergentes y alimentos siguen la misma lógica. Se elige un gen, se clona en un microorganismo y se cosecha lo que ese cultivo produce.

Dos casos resueltos y los errores más frecuentes

Los dos ejercicios usan datos de un laboratorio escolar y se resuelven con sumas y divisiones. Conviene rehacerlos sin mirar la solución.

En el primero conviene recordar que una molécula lineal abierta por n cortes deja n + 1 fragmentos. El segundo mide la eficiencia de la transformación con un cociente simple.

Al resolver, identificá primero el verbo del enunciado. Cortar, unir, transportar y seleccionar corresponden a herramientas distintas, y confundirlas descarta opciones correctas.

Conclusión

Las enzimas de restricción y la ligasa forman la pareja que hizo posible el ADN recombinante. Una corta en un sitio preciso y la otra vuelve a cerrar la molécula.

El vector completa el sistema. Un plásmido bien armado se replica por su cuenta, acepta el fragmento en su sitio de multiclonación y delata con su marcador qué células lo recibieron.

El orden del procedimiento no es caprichoso. Un corte mal hecho arruina la ligadura, y una selección mal planteada deja crecer colonias que no sirven.

La clonación molecular ordena esos elementos en una secuencia repetible: cortar, ligar, transformar, seleccionar y multiplicar. Cada paso prepara el siguiente y ninguno se puede saltar.

La expresión añade una condición extra. Si el gen es humano y tiene intrones, hay que partir del ARN mensajero maduro para que la bacteria logre leerlo.

De ese recorrido salen la insulina aprobada en 1982 y la quimosina que cuaja la leche desde 1990. La misma lógica sostiene las enzimas de detergentes y de alimentos que se usan todos los días.